慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5911-5915.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.002

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慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞

刘晓昌¹，赵英华²，杨子桧³，王磊³

1解放军第四军医大学学员旅12连5班2011级口腔专业，陕西省西安市 710032
2西安交通大学口腔医院修复科，陕西省西安市 710032
3解放军第四军医大学口腔医院口腔颌面外科，陕西省西安市 710032

修回日期:2014-08-22 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 王磊，解放军第四军医大学口腔医院口腔颌面外科，陕西省西安市 710032
作者简介:刘晓昌，男，1993年生，山东省东营市人，汉族，本科在读。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81270015)

Human nerve growth factor beta-modified bone marrow mesenchymal stem cells from the rabbit mandible by transfection of lentiviral vectors

Liu Xiao-chang¹, Zhao Ying-hua², Yang Zi-gui³, Wang Lei³

1Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
2Department of Prosthodontics, Stomatological Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
3Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2014-08-22 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Wang Lei, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Liu Xiao-chang, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81270015

摘要/Abstract

摘要：

背景：中枢或周围神经系统损伤是临床中常见的问题，且治疗效果尚不理想。神经生长因子在神经元细胞损伤修复和生长发育方面具有重要作用，但局部应用的神经生长因子存在易于失活、流失的缺点。
目的：旨在通过慢病毒载体构建人神经生长因子β重组质粒，转染荧光兔下颌骨骨髓间充质干细胞并研究其生物学活性。
方法：采用慢病毒作为载体，经Hind Ⅲ+NotⅠ双酶切法构建含目的基因的pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒。分离和培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞，经重组质粒转染后，应用酶联免疫吸附法检测骨髓间充质干细胞分泌人神经生长因子β的情况。
结果与结论：成功构建了pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP真核表达载体，经酶切鉴定和测序均证明质粒构建完整、正确。质粒转染后兔下颌骨骨髓间充质干细胞在荧光显微镜下可以发出绿色荧光，且荧光强度不随培养时间延长而衰退。转染后兔下颌骨骨髓间充质干细胞表达的人神经生长因子β可以在第7天仍维持在 25 μg/L水平，生物学活性显著提升。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 下颌骨, 骨髓间充质干细胞, 神经生长因子, 慢病毒, 基因转染, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Central nerve damage and peripheral nerve injury are common clinical problems that have no ideal treatment. Nerve growth factor has an important role in neuronal repairing and growth. But its local injections may have shorts of inactivation and loss.
OBJECTIVE: To construct human nerve growth factor beta recombinant plasmids, which are transfected into bone marrow mesenchymal stem cells from the rabbit mandible by lentiviral vectors, and to investigate the bioactivity of human nerve growth factor beta.
METHODS: pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP plasmids were constructed via lentiviral vectors using Hind III+Not I digestion. Bone marrow mesenchymal stem cells from the rabbit mandible were isolated and cultured, and then transfected by recombinant plasmids. The expression of human nerve growth factor beta in transfected cells was detected by ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP plasmids were proved to be constructed successfully by gene sequencing and enzyme identification. The transfected cells under a fluorescence microscope emitted green fluorescence, and the fluorescence intensity had no change with incubation time. The expression of human nerve growth factor beta was maintained at a level of 25 μg/L at 7 days after cell transfection, and the bioacitivty was increased significnalty.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, mandible, nerve growth factor, lentivirus infections

中图分类号:

R394.2

刘晓昌，赵英华，杨子桧，王磊. 慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5911-5915.

Liu Xiao-chang, Zhao Ying-hua, Yang Zi-gui, Wang Lei . Human nerve growth factor beta-modified bone marrow mesenchymal stem cells from the rabbit mandible by transfection of lentiviral vectors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5911-5915.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：基因水平，体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年6月在解放军第四军医大学口腔医学院创伤实验中心完成。

材料：

实验方法：

pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒构建：

hNGFβ基因 PCR：设计上游带有NotⅠ、下游带有Hind Ⅲ的引物，分别为hNGFβ-726-F: 5’-GGA GCT AGC ACC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG-3’ 和hNGFβ-726-R: 5’-CGC AAA GCT TCT AGG CTC TTC TCA CAG CCT TC-3’。以pCL1-hNGFβ为模版扩增hNGF β片段，加入dNTP、10×PCR Buffer、rTaq酶、ddH₂O共20 μL，94 ℃ 5 min变性，94 ℃ 30 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s共循环25次。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物取 5 μL与6×Loading Buffer 1 μL混匀上样，10 V/cm进行电泳。

酶切pDC316-mCMV-EGFP载体质粒和目的基因hNGFβ的PCR产物：在pDC316-mCMV-EGFP载体质粒与hNGFβ的PCR产物中分别加入Hind Ⅲ限制酶(8- 20 U/μL)、NotⅠ限制酶(8-20 U/μL)、10×0.5×K Buffer (Takara)、10×BSA Buffer(Takara)，然后37 ℃水浴酶切3 h。

片段回收与连接、转化：①回收：取25 μL酶切产物与6×Loading Buffer(Takara)5 μL混匀上样，进行1%琼脂糖凝胶电泳，10 V/cm，用V-gene DNA凝胶提取试剂盒回收5.8 kb左右大小的pDC316-mCMV-EGFP质粒片段和 726 bp的hNGFβ目的片段，用于随后的连接反应。②连接：在上述两回收物中加入10×T₄ DNA连接Buffer和T₄ DNA连接酶各1 μL，25 ℃室温连接3 h。③转化：取5 μL连接产物热休克法转化入感受态大肠杆菌DH-5α，次日，挑取平板上的单克隆菌落，接入5 mL LB培养基中在37 ℃摇床中振荡培养18 h，取3 mL菌液用V-gene质粒小量提取试剂盒提取质粒，酶切法筛选正确的重组质粒。

重组质粒pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP的PCR鉴定：取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物取5 μL与6×Loading Buffer(Takara)1 μL混匀上样， 10 V/cm进行电泳。

重组质粒pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP酶切鉴定：取5 μL酶切产物，与1 μL 6×Loading Buffer(Takara)混匀，在1%琼脂糖凝胶上电泳，混匀上样，10 V/cm进行电泳。

基因测序鉴定：将PCR和酶切鉴定正确的pDC316-hNGFβ-CMV-EGFP质粒测序，使用通用引物CMV-f和BGH-r。

分离和培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞：选取成年雄性新西兰兔(解放军第四军医大学动物实验中心提供)，获取其下颌骨，切成细碎的组织块，然后用3 g/L胶原酶Ⅰ和4 g/L分散酶Ⅱ在37 ℃水浴中消化80 min。使用70 μm细胞滤网进行过滤得到单细胞悬液，之后500×g离心5 min。然后将细胞接种于DMEM、体积分数为10%胎牛血清、抗生素(100 U/mL青霉素G，100 g/mL链霉素)的混合培养液中，在37℃，体积分数为5% CO₂，饱和湿度的恒温培养箱中培养。培养3 d后去除上清液，并全量更换新的培养液。当观察到细胞贴壁生长融合时进行传代培养。二次传代培养后的细胞将用于之后的实验。

hNGFβ慢病毒转染骨髓间充质干细胞：将第2次传代培养后的兔下颌骨骨髓间充质干细胞以20 000/cm²的密度接种在6孔板中，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。然后以病毒感染复数(multiplicities of infection, MOI)为10，100，1 000加入纯化的pDC316- hNGFβ-mCMV-EGFP质粒和pDC316-mCMV-EGFP质粒，整个过程中确保密闭孔管清洁无污染。37 ℃下进行板离心(2 000×g离心1.5 h)，以保证转染过程更加彻底。将离心后的沉淀细胞用无菌磷酸盐缓冲液冲洗，然后加入全新的培养基。转染48 h后对细胞进行光学和荧光显微观察。观察到细胞生长接近融合的时候，用0.25%的胰蛋白酶消化分离细胞，之后500×g离心5 min。

重组pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞后hNGFβ表达的检测：取MOI=100慢病毒转染后3，5，7 d的上清液进行hNGFβ的ELISA检测，hNGFβ ELISA试剂盒的使用参照制造商的操作说明书。

统计学分析：所有计量数据都用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行配对t 检验分析和处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

中枢神经损伤和周围神经损伤的修复和再生是外科学领域至今尚未解决困扰着人们的难题。近年来随着分子生物学、细胞生物学和显微外科技术的发展，周围神经损伤后相关神经元的保护、断裂神经干的修复、相应靶器官有效再支配、瘢痕组织形成及压迫等方面均有许多的深入研究^[13]。但是由于神经系统特殊的性质，各类神经损伤修复的效果仍然不尽如人意。基因治疗是通过基因水平的改变来治疗疾病的方法。它能将外源的遗传物质通过特定的载体导入到相应的靶细胞内，然后进行表达发挥其相应的生物学功能。传统的基因治疗是指通过操作遗传物质来干预疾病的发生发展和进程，包括替代和纠正人自身基因结构和功能上的错乱^[14]。近年来，基因导入系统和载体方面的新型治疗方向成为基因治疗的热点。

近年来新建立了慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)系统，它不仅能整合到分裂细胞DNA中，对非分裂细胞也能整合，慢病毒载体对淋巴细胞、干细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率，因此倍受关注^[15-16]。慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其他病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统反转录病毒载体，有鲜明的特色。

大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。作者也在研究中发现慢病毒转染的骨髓间充质干细胞在7 d后仍能将体内的hNGFβ维持在生理需要水平，这表明hNGFβ基因已经成功地整合到骨髓间充质干细胞的DNA上。

间充质干细胞是一类多能干细胞, 最初是从骨髓中发现，是除造血干细胞以外的另一类干细胞。间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经细胞等，其来源多样简单，可从多种组织中分离提取，如骨髓、脐血、脐带、胎盘、脂肪组织、真皮、心、肝、脾、牙髓等^[17-27]，但不同组织来源的间充质干细胞在体外培养过程中保持组织特异性^[28]。它是一种可以自我复制、并具有多向分化潜能的成体干细胞，它具有低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等优点。它不仅可以转入外源基因，而且能分化参与机体修复再生，现在已经成为基因治疗研究中一种理想的种子细胞。

间充质干细胞容易从骨髓中分离并培养，从而可以用作病毒介导的基因修饰的目标。目前并没有发现间充质干细胞有特异性的细胞表面标记，通常认为间充质干细胞不表达造血干细胞的表面标记如 CD45、CD14、CD11 及一些共刺激分子如 CD80、CD86、CD40及CD31，表达 CD105、CD73、CD44、CD90、CD71、CD106、CD29 等^[29]，利用这一性质可以通过免疫组化鉴定验证分离培养后的细胞中间充质干细胞的纯度。本研究中间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法，经过分离、培养、鉴定，成功得到了兔下颌骨骨髓间充质干细胞

本研究中，经慢病毒介导的重组pDC316- hNGFβ-mCMV-EGFP质粒转染兔骨髓间充质干细胞，在转染后的第7天经ELISA检测分泌的hNGFβ依然维持在理想的水平，说明转染的骨髓间充质干细胞可以成功持续表达hNGFβ。今后拟进行动物实验，观察经慢病毒介导的重组pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP质粒转染兔骨髓间充质干细胞移植到动物体内之后的生物学活性，期望其可以成功地发挥应有的生物学功能，保证体内的hNGFβ达到生理需求水平。如果转染后的骨髓间充质干细胞可以发挥明显的生物学活性，那么其有望应用于促进临床各类神经损伤的修复和再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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